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小羅開講 | Digital PCR workflow影響檢測性能的各因素分析

Posted on 2022-09-08 09:18:23 by , 0





 


基于泊松分布將核酸樣本分散到大量微孔或者液滴中(如圖1),相較于qPCR而言,dPCR無需標(biāo)準(zhǔn)曲線(如圖2),抑制成分被有效稀釋(如圖3),讀取結(jié)果方式具備更精確結(jié)果的潛力。盡管有諸多優(yōu)勢,我們?nèi)孕柚匾昫PCR的操作過程、試劑耗材穩(wěn)定性及硬件性能帶來的影響;同時(shí)需針對(duì)性的完善實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié),從而盡可能減少引入的偏差,獲得高靈敏度、高穩(wěn)定性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

圖1.dPCR實(shí)驗(yàn)原理圖例

(來源:羅氏診斷整理)

 

圖2.無需依靠通過標(biāo)準(zhǔn)品繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線

(來源:羅氏診斷整理)

 

 

圖3.將樣本分散到微孔后可以降低體系抑制成分的抑制效果

(來源:羅氏診斷整理)

 

 
 
 

完整的數(shù)字PCR操作流程:

 


a.取樣過程:

 

絕大多數(shù)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)在取樣過程中會(huì)引入取樣偏差,因此在此操作過程中應(yīng)盡量保持取得樣本的操作一致,并且在不提高抑制物濃度的條件下,應(yīng)盡量增大取樣體積,選取低吸附樣本管的耗材。

 

針對(duì)樣本本身,如果是全基因組核酸進(jìn)行數(shù)字PCR研究則需要進(jìn)行片段化處理。細(xì)菌,病毒等樣本通常需要結(jié)合多重靶標(biāo)檢測,實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)需分析靶點(diǎn)序列在基因組上的物理距離,并針對(duì)性的設(shè)計(jì)靶點(diǎn)引物或酶切干預(yù)來減少后續(xù)結(jié)果中出現(xiàn)的多靶標(biāo)連鎖問題。

 


b.體系配置:

 

此步驟主要涉及移液偏差。dPCR儀器移液步驟越多,誤差越大,因此在此操作過程中盡可能減少移液次數(shù),同時(shí)選擇校準(zhǔn)過的最接近量程的移液器結(jié)合合適的低吸附槍頭(如圖4)。

 

移液操作通常為反向移液,對(duì)于低濃度樣本盡可能增加重復(fù)以防止低分子隨機(jī)性因素導(dǎo)致結(jié)果不穩(wěn)定,高濃度探針引物稀釋后移液可以減少批間誤差。以手動(dòng)單道移液器為例(如圖5),同樣是移取20 μl液體,選擇量程是20 μl的移液器時(shí)精度≤±0.8%,換算成體積為±0.16μl;而選擇量程是200μ的移液器時(shí)精度為≤±6%,體積偏差在±1.2μl 。


圖4.dPCR加樣時(shí)吸頭角度

(來源:羅氏診斷整理)

 

圖5.針對(duì)不同量程移液器移液過程的誤差數(shù)據(jù)

(來源:羅氏診斷整理)

 

 


c.分散過程:

 

有效反應(yīng)單元數(shù)量是影響結(jié)果準(zhǔn)確性和精確性的重要因素(如圖6)。以泊松分布為基礎(chǔ)來測算核酸濃度,需要在精度和動(dòng)態(tài)范圍之間取得平衡。相同反應(yīng)單元下,精度要求越高,動(dòng)態(tài)范圍越小,精度要求越小,動(dòng)態(tài)范圍越大,因此提高有效反應(yīng)單元數(shù)量,可同時(shí)提高精度和動(dòng)態(tài)范圍。

圖6.20k,28k,100k微孔數(shù)目下,芯片孔越多,計(jì)算核酸濃度的準(zhǔn)確性越高

(來源:羅氏診斷整理)

 

在反應(yīng)單元一致的前提下,樣本體積越大,越有利于低拷貝基因的檢測。

 

分散過程中的誤差分析:統(tǒng)計(jì)學(xué)樣本濃度均值λ,即平均一個(gè)分區(qū)單元包含λ個(gè)拷貝不一定剛好是真實(shí)模板濃度,需要結(jié)合置信區(qū)間和置信水平表示,數(shù)字PCR中置信水平通常是95%,而針對(duì)置信區(qū)間科研和商業(yè)化公司有多種計(jì)算方式。

 

???絕對(duì)定量誤差分析,見圖例CI區(qū)間(如圖7)。

圖7.dPCR絕對(duì)定量結(jié)果CI統(tǒng)計(jì)區(qū)間

(來源:羅氏診斷整理)

 

???CNV誤差分析更為復(fù)雜,需要目標(biāo)基因和內(nèi)參基因濃度比ratio值及相應(yīng)的聯(lián)合置信區(qū)間進(jìn)行表示,見圖例CI區(qū)間(如圖8)。

圖8.dPCRCNV結(jié)果CI統(tǒng)計(jì)區(qū)間

(來源:羅氏診斷整理)

 


d.信號(hào)采集:

 

信號(hào)采集過程中熒光粉塵、交叉污染,都會(huì)影響正常陰陽單元的判定,可通過在超凈臺(tái)操作有效降低前者的影響。后者往往對(duì)反應(yīng)單元的信噪比和單元間隔絕性有比較高的要求(如圖9),原理上微滴法很難控制微滴間干擾和液滴融合等問題,相較而言以芯片為反應(yīng)單元的數(shù)字PCR設(shè)備可以通過提高微孔工藝進(jìn)而解決此類問題。


圖9.孔之間應(yīng)有較大間隔,可以避開孔之間的交叉干擾,獲取更好的信噪比

(來源:羅氏診斷整理)

 

1D,2D結(jié)果中閾值的判讀也是影響最終結(jié)果的重要因素。由于試劑耗材組分、非特異性擴(kuò)增、探針引物二聚體等現(xiàn)象,導(dǎo)致背景噪音更為明顯,導(dǎo)致陰陽性孔間閾值難以劃分(如圖10)。優(yōu)化探針引物序列和配比、摸索合適的退火溫度、配合低背景芯片耗材(如圖11),同時(shí)結(jié)合硬件,比如結(jié)合使用高分辨率的光學(xué)檢測系統(tǒng)、高性能的PCR溫控系統(tǒng)可以有效提高信噪比,使閾值能夠準(zhǔn)確劃分。


圖10.1D圖陰性(藍(lán)色)與陽性(紅色)信號(hào)應(yīng)考察聚集度、信噪比、有無Rain等指標(biāo)

(來源:羅氏診斷整理)

 


圖11.芯片標(biāo)準(zhǔn)化的六邊形微腔

(來源:羅氏診斷整理)


 

以上就是數(shù)字PCR實(shí)驗(yàn)流程常見的幾類問題和參考性的解決方案。我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中面對(duì)小分子樣本的隨機(jī)性,雖然無法超越不確定性極限達(dá)到確定,但通過細(xì)節(jié)把控和數(shù)據(jù)優(yōu)化,使我們可以通過高效的方案進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

 
 

*MC-CN-02168 有效期至2025年5月16日

活動(dòng)最終解釋權(quán)歸羅氏診斷生命科學(xué)所有。

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